摘要：近在SARS-CoV-2臨床試驗(yàn)中mRNA疫苗的成功應(yīng)用一部分歸功于納米顆粒脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，該系統(tǒng)不*在肌肉注射后有效表達(dá)mRNA編碼的免疫原，而且作為佐劑和疫苗反應(yīng)發(fā)揮作用。我們概述了mRNA遞送系統(tǒng)，并重點(diǎn)介紹了目前SARS-CoV-2疫苗臨床試驗(yàn)中使用的納米顆粒脂質(zhì)體。這篇綜述文末分析了基因疫苗中納米顆粒脂質(zhì)體性能的決定因素。

簡(jiǎn)介

由于COVID-19在全球的大流行，mRNA疫苗被推到了生物技術(shù)和制藥工業(yè)的中心舞臺(tái)。由BioNTech/輝瑞、Moderna、CureVac、Sanofi/TranslateBio、Arcturus/Duke-NUS新加坡醫(yī)學(xué)院、倫敦帝國(guó)理工學(xué)院、泰國(guó)朱拉隆功大學(xué)和Providence Therapeutics領(lǐng)導(dǎo)的mRNA疫苗人體試驗(yàn)共有8個(gè)正在進(jìn)行。

值得注意的是，其中兩項(xiàng)試驗(yàn)已經(jīng)公布了3期臨床中期結(jié)果，報(bào)告了接種2次30 µg或100 µg劑量LNP包裹的編碼刺突蛋白免疫原的mRNA序列后，病毒感ran率降低94%以上。疫苗開(kāi)發(fā)的速度也遠(yuǎn)超出了預(yù)期，在SARS-CoV-2序列*公開(kāi)后10個(gè)月就有了如此**的效果。這一成功不*證明了生物技術(shù)和制藥業(yè)有應(yīng)對(duì)緊急和緊缺的全球性需求的能力，也證明了mRNA作為一種藥物的所具有的能力，在中mRNA作為一種預(yù)防性疫苗。本綜述的目的是概述mRNA遞送系統(tǒng)的發(fā)展、總結(jié)SARS-CoV-2 mRNA疫苗的臨床前和臨床發(fā)現(xiàn)，并將其與其成功的遞送系統(tǒng)特征聯(lián)系起來(lái)。近有幾篇早于爆發(fā)的關(guān)于疫苗和zhi療mRNA遞送系統(tǒng)的的優(yōu)綜述已經(jīng)發(fā)表。

與小分子、DNA、寡核苷酸、病毒系統(tǒng)和蛋白質(zhì)，包括抗體等的其他藥物形式相比，mRNA療法具有許多優(yōu)勢(shì)和幾個(gè)難點(diǎn)。與寡核苷酸和大多數(shù)小分子藥物有限的靶點(diǎn)相比，mRNA可以調(diào)節(jié)刺激和抑制作用方式，也能夠表達(dá)或替換缺陷蛋白，這擴(kuò)大了其使用的潛在適應(yīng)癥范圍。

與DNA相比，mRNA只需要獲得細(xì)胞質(zhì)的核糖體翻譯機(jī)制而不用進(jìn)入細(xì)胞核，因此沒(méi)有整合到人體基因組的風(fēng)險(xiǎn)。與蛋白質(zhì)和病毒系統(tǒng)相比，mRNA的制造是在細(xì)胞外快速制備的，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有天然的糖基化和構(gòu)象性質(zhì)。當(dāng)與脂質(zhì)納米顆粒(LNP)遞送系統(tǒng)結(jié)合時(shí)，mRNA LNP的納米結(jié)構(gòu)特性也與病毒系統(tǒng)和循環(huán)的內(nèi)源性含脂質(zhì)乳糜微粒的大小、脂質(zhì)包膜和內(nèi)部基因組物質(zhì)等方面具有相似性，并且有助于其作為疫苗和其他zhi療藥物的遞送載體材料。

mRNA的難點(diǎn)在于其先天的免疫原性，對(duì)酶降解的敏感性以及細(xì)胞對(duì)裸露的mRNA攝取幾乎可以忽略不計(jì)。mRNA的先天免疫原性是由于toll樣受體(TLRs)、解旋酶受體(包括視黃酸誘導(dǎo)基因I (RIG-I)樣受體(RLRs)等)對(duì)單鏈和雙鏈RNA的識(shí)別，然后這些受體通過(guò)NF-κB和干擾素(IFN)調(diào)節(jié)因子IRF3和IRF7發(fā)出信號(hào)并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與I型IFN基因啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)I型IFN(IFN-α和IFN-β)的表達(dá)，并伴有促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，如**壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-12（IL-12）。分泌的干擾素作為一種病毒防御機(jī)制，通過(guò)其受體和同一細(xì)胞及相鄰細(xì)胞中的JAK/STAT途徑發(fā)出信號(hào)，**300多個(gè)受干擾素刺激的基因，包括蛋白激酶PKR。

雖然這種**可能有利于對(duì)mRNA疫苗產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但直接作用是通過(guò)eIF2a的PKR磷酸化來(lái)下調(diào)翻譯，這樣損害了eIF2的活性，抑制了mRNA翻譯，從而抑制了免疫原的蛋白質(zhì)合成。消除這種先天免疫反應(yīng)的主要方法是將天然存在的核苷如1-甲基二脲苷和核糖體RNA(通常不在mRNA中)中存在的其他核苷替換到mRNA序列中，這使得它不能被先天免疫傳感器檢測(cè)到。這種核苷修飾的免疫應(yīng)答mRNA是mRNA技術(shù)的基礎(chǔ)，該技術(shù)近在BioNTech/輝瑞和Moderna疫苗試驗(yàn)中顯示了超過(guò)94%的有效性，這些技術(shù)是建立在對(duì)其他病原體試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，下文將詳細(xì)描述。

由于TLR7和TLR8主要識(shí)別富含GU的單鏈RNA序列，CureVac采用了第二種方法包括密碼子優(yōu)化和盡量不使用鳥(niǎo)苷酸。mRNAzhi療的第二個(gè)難點(diǎn)是其對(duì)核酸酶的敏感性，例如在它血清中的半衰期< 5分鐘。盡管siRNA的化學(xué)修飾在提高穩(wěn)定性和降低免疫原性方面非常成功，但迄今為止，由于翻譯機(jī)制對(duì)化學(xué)修飾的敏感性，使得它們?cè)趍RNA修飾并不成功。mRNA的第三個(gè)難點(diǎn)是大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型（除不成熟的樹(shù)突細(xì)胞外）缺乏對(duì)裸露的mRNA的細(xì)胞攝取吸收。

后兩個(gè)難點(diǎn)可以通過(guò)將核苷修飾或mRNA導(dǎo)入適宜遞送系統(tǒng)來(lái)解決，這樣既保護(hù)mRNA免受核酸酶的攻擊，又促進(jìn)細(xì)胞攝取。比如，當(dāng)在動(dòng)物模型中給藥時(shí)，與裸露的mRNA相比，加入納米顆粒脂質(zhì)體可保護(hù)mRNA免受核酸酶的攻擊，并增強(qiáng)細(xì)胞攝取和表達(dá)高達(dá)1000倍。

質(zhì)粒DNA主鏈通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄(IVT)產(chǎn)生zhi療性mRNA，其帶有5’端的帽子結(jié)構(gòu)、5’端的非翻譯區(qū)(UTR)、編碼目的蛋白開(kāi)放閱讀框、3’端UTR和polyA尾。天然真核生物的5’端帽子(cap0)是一種倒置的7-甲基鳥(niǎo)苷(m7G)，通過(guò)5’-5’三磷酸鹽與mRNA的**個(gè)核苷酸相連。

Cap0保護(hù)內(nèi)源性mRNA免受核酸酶攻擊，參與核輸出，與翻譯起始因子4結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯。另外兩個(gè)5’端帽子結(jié)構(gòu)被證實(shí)(帽子1和帽子2)在第二個(gè)或第三個(gè)核糖核苷酸上含有額外的甲基，其免疫原性低于cap0(因此更佳)。目前常用的加帽方法包括共轉(zhuǎn)錄加帽，產(chǎn)生具有高翻譯和低免疫原性的帽子1。5’端UTR參與翻譯起始，包含一個(gè)Kozak序列以及一個(gè)非帽依賴(lài)翻譯的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。開(kāi)放閱讀框之后是3’端UTR，它影響mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)的持久性。polyA尾在大約100個(gè)殘基上編碼，有助于啟動(dòng)翻譯和延緩降解。體外轉(zhuǎn)錄（IVT）生產(chǎn)的mRNA需要經(jīng)過(guò)純化，以去除具有免疫原性的DNA和雙鏈RNA污染物。

上述的mRNA可以是核苷修飾的，也可以是未經(jīng)核苷修飾的序列，但不能進(jìn)行自我復(fù)制。能夠復(fù)制的自擴(kuò)增mRNA (samRNA)也正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)測(cè)試，其長(zhǎng)度約為10 kb，由于它們有四個(gè)額外編碼的非結(jié)構(gòu)基因，包括一個(gè)RNA依賴(lài)的RNA聚合酶，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)的自復(fù)制，但由于缺乏結(jié)構(gòu)基因，不會(huì)產(chǎn)生感ran性粒子。

samRNA不能被核苷修飾，因?yàn)檫@些修飾會(huì)干擾自身擴(kuò)增。在目前的臨床試驗(yàn)中，由于samRNA的擴(kuò)增過(guò)程，其通常使用較低的劑量(1-10 µg)，而非擴(kuò)增的mRNA則需使用30-100 µg。表1總結(jié)了目前所有上述類(lèi)別在進(jìn)行人體臨床測(cè)試的mRNA疫苗。這些臨床試驗(yàn)中的所有mRNA遞送系統(tǒng)都是納米顆粒脂質(zhì)體。

BioNTech/輝瑞LNP和Moderna LNP已經(jīng)公開(kāi)其確切方，而其他一些公司尚未公開(kāi)。其他產(chǎn)品很可能與Alnylam公司的 OnpattroTM產(chǎn)品相似(下文將進(jìn)一步描述)，就像已經(jīng)公開(kāi)的產(chǎn)品，可能都包含用的可電離脂質(zhì)。雖然所用的特定可電離脂質(zhì)可能未知，但其常用種類(lèi)可以從期刊和**出版物中了解，如表1所示。

表1：目前在進(jìn)行人體臨床測(cè)試采用納米顆粒脂質(zhì)包裹的mRNA疫苗總結(jié)如下。臨床試驗(yàn)中的所有mRNA疫苗都使用納米顆粒脂質(zhì)體進(jìn)行遞送。其類(lèi)別和組成尚未公開(kāi)，因此基于現(xiàn)有文獻(xiàn)和**，它們可能的類(lèi)別如下所示。

在之前，mRNA疫苗用于傳染病的臨床前和臨床研究，包括流感、寨卡病毒、艾zi病毒、埃博拉病毒、狂犬病、基孔肯雅病毒、瘧疾、生殖器皰疹、弓形蟲(chóng)等。這些研究被總結(jié)在近的一些綜述中。

COVID-19

SARS-CoV-2

LNP：脂質(zhì)納米顆粒

CNE:陽(yáng)離子納米乳劑

NLC納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體

PBAE：聚β氨基酯

PACE：聚(胺-共-酯)

Epo

hPBAE：超支化聚β-氨基酯

PEI：聚乙烯亞胺

pABOL：二硫化物連接的聚酰胺基胺

SPLP：質(zhì)粒-脂質(zhì)顆粒

SNALP：核酸脂質(zhì)顆粒

IFN：干擾素

HAI：血凝抑制試驗(yàn)

CVnCoV：CureVac mRNA LNP

mAbs：?jiǎn)慰寺】贵w

VHH:Vh結(jié)構(gòu)域

M2e:基質(zhì)蛋白2外域

Tfh：濾泡輔助T細(xì)胞